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MEK/ERK-Signalübertragung mit einem klinisch verfügbaren MEK1/2-Inhibitor, Trametinib (GSK1120212, SNR1611), den Schutz von Neuronen durch autophagische lysosomale Aktivierung induziert, die durch den Transkriptionsfaktor EB (TFEB) in einem AD-Modell vermittelt wird.Oral verabreichtes Trametinib stellte bei 5XFAD-Mäusen beeinträchtigte neurale Strukturen, kognitive Funktionen und Hippocampus-Langzeitpotenzierung (LTP) wieder her.Trametinib reduzierte auch die Aβ-Ablagerung durch Induktion der autophagischen lysosomalen Aktivierung.Die RNA-Sequenzanalyse zeigte eine Hochregulierung autophagischer lysosomaler Gene durch die Verabreichung von Trametinib.Darüber hinaus hemmte Trametinib die TFEB-Phosphorylierung an Ser142 und förderte dessen Kerntranslokation, was wiederum autophagische lysosomal verwandte Gene induzierte, was darauf hindeutet, dass Trametinib den autophagischen lysosomalen Prozess durch TFEB-Aktivierung aktiviert.Aus diesen Beobachtungen schlossen wir, dass die MEK-Hemmung einen neuronalen Schutz vor der Aβ-Belastung bietet, indem sie die autophagische lysosomale Aktivität erhöht.Daher kann die MEK-Hemmung eine wirksame therapeutische Strategie für AD sein.Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die typischerweise mit Gedächtnisverlust und kognitiver Beeinträchtigung beginnt, begleitet von neuronalem und synaptischem Verlust in der Großhirnrinde und im Hippocampus.Seine Hauptmerkmale sind die Anhäufung von extrazellulären β-Amyloid (Aβ)-Plaques, intrazellulären neurofibrillären Knäueln, die aus hyperphosphoryliertem Tau bestehen [1, 2].Diese abweichenden Ansammlungen sind an pathophysiologischen Prozessen beteiligt, einschließlich mitochondrialer und lysosomaler Dysfunktion, oxidativem Stress, Neuroinflammation und mehr [3,4,5].Der autophagische lysosomale Weg ist einer der Schlüsselmechanismen zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase, indem zytotoxische Proteinaggregate, langlebige Proteine, dysfunktionale Zellorganellen und eingedrungene Pathogene entfernt werden [6, 7].Autophagie ist an der neuronalen Entwicklung sowie an Funktionen und Überleben von Neuronen beteiligt, und Defekte in der Autophagie wurden mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht [8].Mäuse, denen essentielle Autophagie-bezogene Gene, insbesondere Atg5 oder Atg7, im Zentralnervensystem fehlten, zeigten einen fortschreitenden neuronalen Verlust und eine Akkumulation abnormaler Proteine, die schließlich zu einer Neurodegeneration führten [9, 10].Autophagische Vakuolen sammeln sich in Neuriten und Synapsen in AD-Gehirnen an, was auf Defekte in der Autophagosom-Reifung und Fusion mit einem Lysosom hindeutet [11, 12].Darüber hinaus senkt die durch mTOR-Hemmung induzierte Autophagie die Spiegel von Amyloid-β und phosphoryliertem Tau und verbessert so synaptische und kognitive Defizite im AD-Tiermodell [13,14,15].Daher scheint die neuronale Autophagie eine entscheidende Rolle bei der Synapsenplastizität zu spielen, die für Lernen und Gedächtnis erforderlich ist [16], und die Hochregulierung der Autophagie ist eine vielversprechende Strategie, um AD-verursachende Proteine ​​zu eliminieren und die neuronale Funktion wiederherzustellen.Der Mitogen-aktivierte Kinase-Weg (Ras/Raf/MEK/ERK-Weg) vermittelt die intrazelluläre Signalübertragung, die an Zellproliferation, -überleben und -tod beteiligt ist [17, 18].Neuere Erkenntnisse haben die Implikation des MEK/ERK-Signalwegs in der Pathogenese von AD gezeigt [19,20,21], während die molekularen Mechanismen, durch die er zur Pathogenese von AD beiträgt, noch nicht vollständig verstanden sind.Phospho-MEK1 wird in der grauen Substanz des temporalen Kortex von AD-Patienten akkumuliert [22].ERK wird im Gehirn von AD-Mausmodellen [23, 24] und im Liquor (CSF) von AD-Patienten aktiviert [25].Darüber hinaus verursachen Aβ42-Fibrillen eine abnormale Tau-Phosphorylierung und eine dystrophische Neuritenproduktion durch ERK-Aktivierung [20, 26].Frühere Berichte haben gezeigt, dass die ERK-Signalgebung die Expression von Autophagie- und lysosomalen Genen durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors EB (TFEB) moduliert [27] und TFEB beschleunigt, um die Aβ-Erzeugung durch lysosomalen Abbau zu reduzieren [28].Ein Therapeutikum, das den MEK/ERK-Weg selektiv hemmen könnte, wurde jedoch noch nicht in der AD-Behandlung evaluiert.Trametinib (GSK1120212, SNR1611) ist ein von der US Food and Drug Administration zugelassenes Krebsmedikament für Melanompatienten zur gleichzeitigen Hemmung von MEK1 und MEK2 (MEK1/2-Inhibitor) [29].Hier testeten wir die therapeutische Wirksamkeit von Trametinib in 5XFAD-Mäusen, die das humane Amyloid-Vorläuferprotein (APP) und Presenilin 1, das fünf familiäre AD-Mutationen enthält, co-überexprimieren [30], und untersuchten die Mechanismen der MEK-Hemmung in der Aβ-assoziierten autophagischen lysosomalen Aktivität.Nach oraler Verabreichung rettete Trametinib die kognitiven Funktionen und die Hippocampus-Langzeitpotenzierung (LTP) und reduzierte die Aβ-Ablagerung durch Induktion des autophagischen lysosomalen Abbaus.Wir haben gezeigt, dass Trametinib die autophagische Aktivität erhöht, indem es die Expression von Autophagie- und Lysosom-bezogenen Genen durch TFEB-Aktivierung in vivo und in vitro reguliert.Daher schließen wir, dass die MEK-Hemmung durch Aktivierung der autophagischen und lysosomalen Clearance von Aβ ein wirksamer therapeutischer Ansatz für AD ist.B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) (5XFAD) und altersangepasste WT (B6SJLF1/J)-Mäuse wurden von Jackson Laboratory gekauft und ICR-Mäuse wurden von OrientBio Inc. erhalten. Die experimentellen Verfahren wurden gemäß den von genehmigten Protokollen durchgeführt das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von KPCLab (zugelassene Nummer: P171011).C57BL/6-Mäuse wurden von OrientBio Inc. bezogen, und die Einhaltung relevanter ethischer Vorschriften und Tierverfahren wurde vom Seoul National University Hospital IACUC überprüft und genehmigt (zugelassene Nummer: 16-0043-c1a0).Trametinib (MedChemExpress) wurde mikronisiert und in dem Vehikel suspendiert, das 5 % Mannitol, 1,5 % Hydroxypropylmethylcellulose und 0,2 % Natriumlaurylsulfat enthielt.Für die pharmakokinetische Analyse wurden 0,05, 0,2 und 0,8 mg/kg Trametinib 7 Wochen alten ICR-Mäusen (n = 5 pro Gruppe) als Einzelgabe oral verabreicht.Für die pharmakodynamische Analyse und RNA-Sequenzierung wurde 0,1 mg/kg/Tag Trametinib 6 Wochen alten C57BL/6-Mäusen 1–4 Wochen lang oral verabreicht (n = 3 pro Gruppe).Die Mäuse wurden zu jedem identischen Zeitpunkt getötet.5XFAD-Mäuse (männlich, n = 7–10 pro Gruppe) erhielten Vehikel oder 0,1 mg/kg Trametinib für 10 Wochen einmal täglich per Schlundsonde.Alle Mäuse wurden durch das Perfusionsverfahren getötet.RNA wurde aus ganzen Gehirnen von Mäusen isoliert, und cDNA-Bibliotheken wurden mit dem TruSeq Stranded mRNA Prep Kit (Illumina) [31] erstellt.Die Bibliotheken wurden auf der Illumina NextSeq500-Plattform sequenziert, und die Reads wurden mithilfe von Tophat v2.0.13 dem Referenz-Maus-mm10-Genom zugeordnet.Insgesamt 24.532 Gene wurden auf das Transkriptom der Maus kartiert, und die Gene, die in mindestens einer Probe nicht abgelesen wurden, wurden entfernt.Es gab insgesamt 15.727 Gene nach dem Entfernen von Genen mit 0 Zählwerten.Um differenziell exprimierte Gene (DEG) mithilfe der DESeq2 R-Bibliothek zu definieren, haben wir einen strengen statistischen Grenzwert für die log2-fache Änderung (FC) von ≥ 1,1 oder ≤ –1,1 und eine falsche Entdeckungsrate (FDR) <0,05 festgelegt.Die Genontologie wurde mit dem biologischen Verfahren unter Verwendung der Panther-Datenbank durchgeführt.Der Signifikanzschwellenwert für Analysen wurde auf 0,05 festgelegt, wobei Fishers exakte testbereinigte p-Werte verwendet wurden.Der aus log10 FPKM berechnete Z-Score pro Gen wurde durch Morpheus-Heatmap von autophagischen lysosomal-verwandten Genen dargestellt.Mäuse wurden in die Mitte des Y-Labyrinths gesetzt und ihre Aktivität wurde 3 Minuten lang aufgezeichnet.Das Y-Labyrinth ist ein dreiarmiges Labyrinth mit 120◦ Winkeln zwischen jedem Arm (40 cm lang × 15 cm hoch).Die Videoverfolgung wurde unter Verwendung der Smart-Videoverfolgungssoftware (Panlab) durchgeführt, und die Reihenfolge und Anzahl der Eingaben in jeden Arm wurden aufgezeichnet.Spontaner Wechsel wurde gezählt, wenn eine Maus nacheinander in die drei Arme eindrang, ohne einen vorherigen Arm zu besuchen.Die Experimentatoren waren hinsichtlich der Behandlungsbedingungen verblindet und randomisiert.Die Mäuse wurden in einer leeren offenen Feldarena (40 cm × 40 cm) gewöhnt.Für den Trainingsversuch wurden Mäuse für jeweils 10 min in eine offene Feldarena mit zwei identischen Objekten gesetzt.Am nächsten Tag wurde der Probelauf für 10 min durchgeführt, wobei einer der beiden bekannten Gegenstände durch einen neuen ersetzt wurde.Das Video-Tracking wurde mit der Smart-Video-Tracking-Software (Panlab) durchgeführt, und die Erkennung bekannter und neuer Objekte wurde als Prozentsatz der Zeit berechnet, die für neue Objekte aufgewendet wurde, bezogen auf die Zeit, die für die Erkundung aller Objekte aufgewendet wurde.Künstliche Cerebrospinalflüssigkeiten mit hohem Saccharosegehalt (ACSF) wurden als 0,5 mM CaCl2, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 5 mM MgSO4, 205 mM Saccharose, 5 mM HEPES, 10 mM Glucose, 26 mM NaHCO3 (pH = 7,3-7,4, mOsm = 300–310).Aufzeichnendes ACSF wurde als 126 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 10 mM Glucose, 26 mM NaHCO3, 5 mM HEPES (pH = 7,3–7,4, mOsm = 300–310) hergestellt.ACSFs wurden nach Bedarf täglich frisch zubereitet.ACSF mit hohem Saccharosegehalt wurde über Eis gehalten und durch Gasinfusion von 95 % O2/5 % CO2 für mindestens 20 Minuten gesättigt.Das Gehirn wurde schnell, in weniger als 4 min, geerntet und für 2 min in prä-oxygeniertem ASCF mit hohem Saccharosegehalt gekühlt.Hippocampus-Schnitte wurden mit einem VF-200-Vibratom (Präzisionsinstrument) koronal auf 300 μm geschnitten.Zur Inkubation der Scheiben wurden sie über einem Nylonnetz in mit 95 % O2/5 % CO2 angereichertem ASCF für 30 min bei 32–34 °C eingetaucht und vor der ersten Aufzeichnung weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.Die Aufnahmescheibe wurde vor Beginn des Experiments 30 min lang in der sauerstoffangereicherten ACSF mit 2 ml/min bei 28–30 °C in der Patch-Clamp-Kammer perfundiert.Wir verwendeten 4–8 MΩ Borosilikat-Kapillarglaselektroden (AM Systems), die aus dem Mikropipettenzieher P-1000 (Sutter Instrument) gezogen wurden.Die intrazelluläre Lösung bestand aus 140 mM K-Gluconat, 10 mM KCl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2ATP, 0,3 mM Na2GTP in 290 mOsm und pH 7,3 eingestellt durch KOH.Zum Einsatz kam HEKA EPC-10 Verstärkerdoppel (HEKA Elektronik).Das Schnittbild wurde unter einem aufrechten Eclipse FN1-Mikroskop (Nikon) durch die Infrarotstrahl-Differenz-Interferenz-Kontrast (IR-DIC)-Optik mit 400-facher Vergrößerung überwacht.Ein exzitatorischer postsynaptischer Strom (EPSC) wurde im Voltage-Clamp-Modus bei –70 mV Haltepotential in einem CA1-Pyramidenneuron aufgezeichnet.Der Zugangswiderstand in der Aufzeichnungszelle lag unter 40 MΩ mit einer marginalen Toleranz von 20 %.Um das Neuron zu stimulieren, wurde eine bipolare Elektrode (FHC) im externen Stimulator Iso-flex (AMPI) an der Schaffer-Kollaterale in einem Abstand von 200 bis 400 μm von der Aufzeichnungselektrode positioniert.Teststimulationsimpulse wurden an derselben Stelle alle 30 s mit 30–40 % Intensitäten von der maximalen EPSC-Amplitude 3 min vor der folgenden Theta-Burst-Stimulation (TBS) zur LTP-Induktion angelegt.TBS bestand aus vier Zügen mit 10-Sekunden-Intervallen, und jeder Zug bestand aus 10 Bursts bei 5 Hz, wobei jeder Burst vier Impulse bei 100 Hz hatte.EPSCs wurden 20 min nach der TBS-Anwendung aufgezeichnet.Die Daten wurden bei 1 kHz gefiltert und mit der Clampfit-Software (Molecular Devices) analysiert.Mäuse wurden mit PBS perfundiert, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd.Gehirnhälften wurden sagittal in Paraffin eingebettet und in 5-μm-Scheiben geschnitten [32].Die Schnitte wurden entparaffiniert und die Antigengewinnung wurde in 10 mM Natriumcitratpuffer (pH 6,0) (Sigma-Aldrich, S4641) durchgeführt.Die Schnitte wurden mit primären Antikörpern inkubiert, gefolgt von sekundären Antikörpern und mit DAPI gegengefärbt.Die Immunfluoreszenzbilder wurden unter Verwendung eines LSM700-Mikroskops (Carl Zeiss) aufgenommen.Die Bilder wurden mit den Softwares Icy (Quantitative Image Analysis Unit) und Zen (Carl Zeiss) quantifiziert.Die Zellzählung wurde von Forschern durchgeführt, die bezüglich der Behandlungsbedingungen blind waren, und nach dem Zufallsprinzip den Gruppen zugeteilt.Die Großhirnrinde wurde in Puffer (250 mM Saccharose, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDGA, 1 mM EGTA, Protease-Inhibitoren) homogenisiert.Homogenisierte Proben wurden mit kalter Ameisensäure gemischt und für 1 Minute beschallt.Nach Zentrifugation bei 135.000 x g für 1 Stunde bei 4 °C wurden die Überstände in Ameisensäure-Neutralisationslösung (1 M Tris HCl, 0,5 M Na2HPO4, 0,05 % NaN3) verdünnt.Die Konzentration von unlöslichem Aβ42 und Aβ40 und die Plasma-Aβ40-Spiegel wurden mit einem Sandwich-ELISA-Kit (Invitrogen, KHB3441/KHB3481) bestimmt.Primäre Neuronen wurden aus ICR-Mäusembryos von Tag 17–18 gewonnen.Die Zellen wurden in neurobasalem Medium kultiviert, das mit 2 % B27, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 &mgr;g/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt war.SH-SY5Y-Neuroblastomzellen wurden in DMEM/F12-Nährstoffmischung (Invitrogen), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 &mgr;g/ml Streptomycin, kultiviert.Die shRNAs [Kontrolle (Santa Cruz, sc-108060), TFEB (Santa Cruz, sc-38510-SH), MEK1 (Dharmacon, V3SM11241-234594572) und MEK2 (Dharmacon, V3SM11241-235104473)] wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Thermo , 11668019).Menschliches Aβ42-Peptid (Anaspec, AS-64129-1, 1 mg) wurde in 100 &mgr;l DMSO durch 30-minütiges Vortexen bei Raumtemperatur gelöst und zu 900 &mgr;l PBS gegeben.Es wurde bei 4 °C für 24 h zur Oligomerbildung inkubiert, wie zuvor beschrieben [33].Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, 15 min in 4 % Paraformaldehyd fixiert und 5 min in 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert.Die Zellen wurden für 1 Stunde in Blockierungslösung (5 % BSA) gegeben und mit primären Antikörpern für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.Nach dem Waschen wurden die Zellen über Nacht mit sekundären Antikörpern inkubiert.Deckgläser wurden unter Verwendung von Eindeckmedium (Biomeda) montiert.Der Koeffizientenprozentsatz wurde unter Verwendung der Pixel über der Schwelle der Fluoreszenzintensitäten berechnet.Zur Messung des intralysosomalen pH-Werts wurden die Zellen mit 500 nM LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen) für 30 min bei 37 °C gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert.Die Fluoreszenzintensität wurde unter konfokaler Mikroskopie unter Verwendung eines LSM700-Mikroskops (Carl Zeiss) beobachtet.Die Anzahl der LysoTracker-Punkte wurde mit der Icy-Software (Quantitative Image Analysis Unit) analysiert.Primäre Hippocampusneuronen wurden mit GFP-Plasmid-DNA unter Verwendung von Lipofectamin (Invitrogen, 11668019) transfiziert, und die Fluoreszenzintensität wurde unter konfokaler Mikroskopie unter Verwendung eines LSM880-Mikroskops (Carl Zeiss) beobachtet.Proteine ​​wurden mit RIPA-Puffer (65 mM Tris-Base, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,25 % Na-Desoxycholat, 1 mM EDTA, Protease-Inhibitoren, pH 7,4) extrahiert und bei 13.000 U/min für 20 min bei 4 °C zentrifugiert .Für die subzelluläre Fraktionierung wurden die Zellen mit Puffer (250 mM Saccharose, 20 mM HEPES, pH 7,4, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Protease-Inhibitor) für 30 min auf Eis lysiert, gefolgt von Zentrifugation bei 720 g für 5 min bei 4 °C.Die Überstände wurden bei 15.000 U/min für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wurde als Cytosolfraktion verwendet.Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 720 g wurden die Pellets mit Lysepuffer gewaschen und in Kernlysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 10 % Glycerol) gelöst ) als Kernfraktion.Gesamthirnlysate von AD-Patienten und altersangepassten Kontrollen wurden von Genetex, MyBioSource und BioChain erworben (Ergänzungstabelle 1).Proteinproben wurden einer SDS-PAGE unterzogen und auf eine Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluoridmembran übertragen.Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in TBS mit 0,1 % Tween 20 für 1 h bei Raumtemperatur blockiert, dann mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert.Nach dem Waschen wurden die Membranen mit sekundären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.Die Peroxidase-Aktivität wurde mit verstärkter Chemilumineszenz sichtbar gemacht und unter Verwendung eines LAS-4000-Systems (Fuji Film) quantifiziert.Die in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.Die Cathepsin-B-Aktivität wurde aus Zelllysat unter Verwendung des Cathepsin-B-Aktivitätskits (Calbiochem, CBA001) gemäß den Anweisungen des Lieferanten gemessen.Kurz gesagt wurden die Lysate 30 min auf Eis inkubiert und 20 min bei 13.000 U/min zentrifugiert.Die Aktivität von Cathepsin B wurde dann aus dem Überstand unter Verwendung eines synthetischen Substrats bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen.Die DNA-Fragmentierung wurde unter Verwendung des DeadEnd TM Fluorometric TUNEL System (Promega, G3250) gemäß den Anweisungen des Lieferanten bestimmt.Kurz gesagt, die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert, mit dem TUNEL-Reagenz und der fluoreszierenden dUTP-Mischung für 1 h bei 37 °C markiert.Die Fluoreszenzintensität wurde unter konfokaler Mikroskopie unter Verwendung eines LSM880-Mikroskops (Carl Zeiss) beobachtet.Die LDH-Aktivität in wurde unter Verwendung des LDH Cytotoxicity Detection Kit (Roche, 04744934001) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRIzol (Invitrogen, 15596018) extrahiert.Reverse Transkription wurde unter Verwendung von M-MLV reverser Transkriptase (Invitrogen, 28025013) durchgeführt.qRT-PCR wurde unter Verwendung des SYBRTM Green PCR-Mastermix (Thermo, 4367659) gemäß den Richtlinien des Herstellers in QuantStudio 3 (Invitrogen, A28567) durchgeführt.Die Ergebnisse wurden relativ zum Haushaltsgen GAPDH ausgedrückt.Die Grundierungssätze sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben.Alle Daten wurden mit der Software GraphPad Prism 9 analysiert.Die statistische Signifikanz wurde mittels Student's t-Test, Einweg-ANOVA oder Zweiweg-ANOVA-Test gefolgt von Dunnett's Post-Hoc-Analyse bewertet.Bewertungen mit p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.Zur Beurteilung des Zugangs von Trametinib zum Gehirn testeten wir zunächst die Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​bei Mäusen.Nach einer einzelnen oralen Verabreichung an ICR-Mäuse durchdrang Trametinib die BHS, und das Verhältnis von Gehirn zu Plasma (AUC-Verhältnis) lag je nach Trametinib-Dosierung im Bereich von 47,7 % bis 64,2 % (ergänzende Abb. 1A, ergänzende Tabelle 4).Nach täglicher Verabreichung von Trametinib für 1-4 Wochen nahm der Spiegel von phosphoryliertem ERK1 / 2 im Gehirn deutlich ab (ergänzende Abb. 1B).Um die Wirkung von Trametinib auf AD-bedingte Pathologien zu bestimmen, wurde 5 Monate alten 5XFAD-Mäusen 10 Wochen lang entweder Vehikel oder 0,1 mg/kg Trametinib einmal täglich per Schlundsonde verabreicht.Im Y-Labyrinth-Test, der zur Bewertung des räumlichen Kurzzeit-Arbeitsgedächtnisses verwendet wurde, beobachteten wir einen signifikanten Rückgang der spontanen Veränderung bei Vehikel-verabreichten 5XFAD-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen.Im Gegensatz dazu zeigten mit Trametinib behandelte 5XFAD-Mäuse ein verbessertes räumliches Arbeitsgedächtnis im Vergleich zu nicht behandeltem 5XFAD (Abb. 1A, ergänzende Abb. 2A).Die gesamten Armeinträge unterschieden sich zwischen den Gruppen im Y-Labyrinth-Test nicht signifikant (ergänzende Abb. 2B).Wir haben die nichträumliche Langzeitgedächtnisfunktion mit dem neuartigen Objekterkennungstest weiter getestet.Trametinib verbesserte auch das neuartige Objekterkennungsgedächtnis von 5XFAD-Mäusen im Vergleich zu Vehikel-behandeltem 5XFAD (Abb. 1B).Wir haben keinen signifikanten Unterschied zwischen Vehikel-verabreichten und Trametinib-behandelten WT-Mäusen in Y-Labyrinth- und neuartigen Objekterkennungstests beobachtet (ergänzende Abb. 2C, D).Diese Ergebnisse zeigen, dass oral verabreichtes Trametinib kognitive Dysfunktionen bei 5XFAD verbessert.A Den 5 Monate alten transgenen 5XFAD-Mäusen wurde Vehikel oder 0,1 mg/kg Trametinib 10 Wochen lang einmal täglich per Schlundsonde verabreicht.Am Ende der Verabreichung wurde ein Y-Labyrinth-Test durchgeführt und das durchschnittliche Verhältnis für den Wechsel in 3 Minuten berechnet.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 11) = 16,5, p = 0,0005; n = 4–5) dargestellt.B Ein neuartiger Objekterkennungstest wurde durchgeführt und das durchschnittliche Verhältnis der Untersuchungszeit in 10 min wurde berechnet.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM-Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 24) = 5,335, p = 0,0121; n = 9) dargestellt.C Normalisierte EPSC-Steigung in LTP-Aufzeichnungen von der CA1-Aufzeichnungselektrode.Die Basislinie wurde 3 min vor der TBS-Induktion (roter Pfeil) und der folgenden 20-minütigen Aufzeichnung im WT-Vehikel (schwarzer Kreis; n = 8 Scheiben von 6 Mäusen), 5XFAD-Vehikel (blaues Quadrat; n = 4 Scheiben von 3 Mäuse) und 5XFAD-Trametinib (rotes Dreieck; n = 6 Scheiben von 3 Mäusen).Repräsentative EPSCs werden für jeden Typ mit Basislinie (blasse Farbe) und Reaktion nach 20 min (lebendige Farbe) angezeigt.Maßstabsleiste: 20 ms, 100 pA.D Durchschnitt der normalisierten EPSC-Steigungen von 15,5 min bis 20 min.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 153) = 36,08, p < 0,001) dargestellt.E Repräsentative Western-Blot-Analyse von 5XFAD-Mäusehirnkortex-Lysaten für PSD-95 und Synaptophysin.Als Ladekontrolle wurde α-Tubulin verwendet.F-Balken entsprechen der densitometrischen Analyse der PSD-95-Spiegel (F(2, 6) = 25,77, p = 0,0011; n = 3) und Synaptophysin (F(2, 6) = 9,836, p = 0,0128; n = 3) .Normiert auf die WT-Fahrzeuggruppe.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse dargestellt.G Immunfluoreszenzfärbungsbilder von MAP2, pNF-H, aktiver Caspase 3 in der Kortexschicht V von 5XFAD-Mäusen.Maßstabsbalken, 50 μm.HJ Quantifizierung der Neuritenlänge (F(2, 98) = 7,385, p = 0,001) (H), pNF-H-positiver knollenartig geschwollener Axonbereich (F(2, 6) = 20,57, p = 0,0021) (I ) und Anzahl der apoptotischen Zellen (F (2, 6) = 25,73, p = 0,0011) (J) in der Kortexschicht V (n = 3 Sagittalschnitte von jeder Maus, n = 3 Mäuse pro Gruppe).Normiert auf die WT-Fahrzeuggruppe.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse dargestellt.K Primäre Hippocampus-Neuronen (DIV22) wurden mit GFP-Plasmid-DNA transfiziert, mit 100 nM Trametinib und/oder 5 μM Aβ42-Oligomer für 48 h behandelt, und die dendritische Spine-Dichte wurde gemessen.L Quantifizierung der Anzahl dendritischer Stacheln.Maßstabsleiste = 20 μm.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Zweiweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(3, 55) = 20,12, p < 0,001; n = 17) dargestellt.* p < 0,05;** p < 0,01;*** p < 0,001.Die EPSCs wurden in der CA1-Region des Hippocampus aufgezeichnet, um die LTP zwischen Wildtyp- und 5XFAD-Mäusen im Alter von 8 Monaten zu vergleichen.Wie zuvor berichtet [34], war LTP in der 5XFAD-Vehikelgruppe im Vergleich zu mit Vehikel behandelten WT-Mäusen signifikant beeinträchtigt (Abb. 1C, D).Die Verabreichung von Trametinib über drei Monate stellte die LTP von 5XFAD-Mäusen auf WT-Niveaus wieder her.Als nächstes analysierten wir die Spiegel des präsynaptischen Markers Synaptophysin und des postsynaptischen Markers PSD-95, um die Schutzwirkung von Trametinib gegen synaptische Degeneration im Kortex von 5XFAD-Mäusen zu bestimmen [35].Wir fanden heraus, dass die Synaptophysin- und PSD-95-Spiegel im Cortex von 5XFAD verringert waren und Trametinib sie auf WT-Mäusespiegel zurückführte (Abb. 1E, F).Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass Trametinib die gestörten neuronalen Netzwerke im Kortex von 5XFAD-Mäusen wiederherstellt.Ähnlich wie bei den beobachteten Gehirndaten von Mäusen erholte sich Trametinib von Aβ42-induzierter Reduktion von Synaptophysin und PSD-95 in primär kultivierten Neuronen, wie durch Immunoblot (ergänzende Abb. 3A – C) und Immunzytochemie (ergänzende Abb. 3D, E) bewertet.Um festzustellen, ob Trametinib die missgebildeten Dendriten im 5XFAD-Mauskortex wiederherstellt, haben wir die Länge der Dendriten mit dem dendritischen Marker MAP2 gemessen.Während die Länge der Dendriten im Kortex von 5XFAD-Mäusen signifikant verkürzt war, wurde sie bei den mit Trametinib behandelten 5XFAD-Mäusen wiederhergestellt (Abb. 1G, H).Darüber hinaus waren pNF-H-positive knollenartig geschwollene Axone, ein Indikator für eine axonale Verschlechterung aufgrund einer Ansammlung von Aβ-Plaques in den Gehirnen von AD-Patienten und alten Affen [36, 37], in Vehikel-verabreichtem 5XFAD im Vergleich zu denen in erhöht WT, während es bei 5XFAD-Mäusen durch Trametinib signifikant reduziert wurde (Abb. 1G, I).Der Anstieg der synaptischen Proteinspiegel induziert die Bildung von Dornen [38, 39].Übereinstimmend fanden wir heraus, dass Aβ42-Oligomere die Anzahl dendritischer Stacheln signifikant verringerten, während Trametinib sie in primären Hippocampus-Neuronen wiederherstellte (Abb. 1K, L).Die 5XFAD-Mäuse zeigten einen aktiven Caspase-3-positiven apoptotischen neuronalen Tod, der durch eine Amyloidbelastung verursacht wurde [40], während die Behandlung mit Trametinib die aktive Caspase-3 im Kortex von 5XFAD-Mäusen reduzierte (Abb. 1G, J).Um die neuroprotektive Wirkung von Trametinib weiter zu klären, testeten wir, ob die Behandlung mit Trametinib SH-SY5Y-Zellen und primäre kortikale Neuronen vor Apoptose schützt, die durch Aβ42-Oligomer induziert wird.Trametinib reduzierte die Aβ42-Oligomer-induzierte Spaltung von PARP und die Aktivierung von Caspase-3 in SH-SY5Y-Zellen (ergänzende Abb. 4A–C).Darüber hinaus verhinderte Trametinib den durch Aβ42-Oligomer induzierten Tod primärer kortikaler Neuronen, wie durch TUNEL (ergänzende Abb. 4D, E) oder LDH-Assay (ergänzende Abb. 4F) festgestellt wurde.Diese Ergebnisse implizieren, dass Trametinib nicht nur die synaptische Integrität schützt, sondern auch Axone und Dendriten vor Amyloid-Plaque-Toxizität schützt.Als wir die Aβ-Ablagerung im Cortex von 5XFAD-Mäusen verglichen, reduzierte die Verabreichung von Trametinib die Fläche der Aβ-Plaques signifikant (Abb. 2A, B).Anschließend analysierten wir die Konzentrationen an unlöslichen Amyloiden im Kortex von 5XFAD unter Verwendung von ELISA.Die Spiegel von unlöslichem Aβ42 und Aβ40 in Trametinib-verabreichtem 5XFAD waren um 51 % bzw. 49 % reduziert, verglichen mit denen in den Vehikel-verabreichten 5XFAD-Mäusen (Abb. 2C, D).Der Aβ-Spiegel wird durch seine Produktions- und Abbaurate bestimmt [41, 42].Um zu fragen, ob Trametinib die Aβ-Produktion beeinflusst, haben wir die Konzentrationen des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) und seiner intermediären Spaltprodukte, C-terminalen Fragmente (CTFs), bestimmt.Die Behandlung mit Trametinib veränderte die Spiegel von APP, CTFβ und CTFα im Kortex von 5XFAD-Mäusen nicht (Abb. 2E–G).Darüber hinaus wurden die Spiegel von MMP-9 und Neprilysin, Aβ-abbauenden Proteasen [41], durch Trametinib bei 5XFAD-Mäusen und Aβ-behandelten primären kortikalen Neuronen nicht verändert (ergänzende Abb. 5A–F).Darüber hinaus gibt es keinen Unterschied im Plasmaspiegel von Aβ40 zwischen mit Vehikel und Trametinib behandelten 5XFAD-Mäusen, was darauf hindeutet, dass Trametinib den Ausfluss von Aβ aus dem Gehirn nicht beeinflusst (ergänzende Abb. 5G).Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass Trametinib die Aβ-Ablagerung reduziert, wahrscheinlich durch Verstärkung des intrazellulären Abbaus von Aβ.A Repräsentative Bilder der Kortexschicht V, die mit dem Aβ-Antikörper (Klon 4G8) immungefärbt wurde (n = 3 Sagittalschnitte von jeder Maus, n = 3 Mäuse pro Gruppe).Maßstabsbalken, 50 μm.B Quantifizierung der Plaquefläche.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 6) = 178,1, p < 0,001) dargestellt.C, D Die Spiegel von unlöslichem Aβ42 (F(2, 6) = 34,07, p = 0,0005) (C) und Aβ40 (F(2, 6) = 66,11, p < 0,001) (D) im Kortex von 5XFAD-Mäusen waren gemessen durch ELISA.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse dargestellt.E Repräsentative Western-Blot-Analyse von 5XFAD-Mäuse-Hirnkortex-Lysaten für angezeigte Proteine.Als Ladekontrolle wurde α-Tubulin verwendet.F-Balken entsprechen der densitometrischen Analyse des APP-Niveaus.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM-Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 6) = 3,095, p = 0,1193; n = 3) dargestellt.G-Balken entsprechen der densitometrischen Analyse des CTF-Niveaus (F(2, 6) = 3,673, p = 0,0909; n = 3).Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse dargestellt.* p < 0,05;** p < 0,01;*** p < 0,001 versus 5XFAD-Veh-Gruppe.Um zu untersuchen, wie Trametinib die synaptische Dysfunktion und die Aβ-Ablagerung reguliert, identifizierten wir Gene, die durch Trametinib in Bulk-RNA-Seq aus ganzen Gehirnen von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen transkriptionell reguliert werden.Zwischen den mit Vehikel und Trametinib behandelten Gruppen wurden insgesamt 836 differenziell exprimierte Gene (DEGs) hochreguliert und 575 DEGs herunterreguliert (Ergänzungstabelle 5, 6).Die genetische Ontologieanalyse ergab, dass Trametinib die negative Regulation der Transkription durch RNA-Polymerase und die Autophagie-bezogene Genexpression hochregulierte, aber die sensorische Wahrnehmung des chemischen Stimulus, die positive Regulation des Neuronentods und die negative Regulation von Genen im Zusammenhang mit der Amyloid-Beta-Clearance herunterregulierte (Ergänzende Abb 6).Angesichts der Tatsache, dass Trametinib den Aβ-Abbau in 5XFAD-Mäusen erhöht und die autophagiebezogene Genexpression aus der RNA-Seq-Analyse reguliert und dass der autophagische lysosomale Weg ein wichtiger Abbaumechanismus in der Amyloidpathologie ist [43], untersuchten wir die Expressionsmuster des zuvor berichteten 322 weiter autophagische lysosomal verwandte Gene [44].Eine Whole-RNA-Seq-Analyse ergab, dass Trametinib die Expression einer Untergruppe von autophagischen lysosomal assoziierten Genen hochreguliert.Insbesondere wurden 29 Gene, die innerhalb des autophagischen Signalwegs funktionieren, unterschiedlich hochreguliert, wie durch die Genexpressions-Heatmap veranschaulicht (Abb. 3A, Ergänzungstabelle 7).Diese Ergebnisse zeigen, dass Trametinib die autophagische lysosomale Aktivität im Gehirn induziert.Tatsächlich stieg der Spiegel des autophagischen Markers LC3-II, der bei den 5XFAD-Mäusen höher war als bei WT-Mäusen, bei den Trametinib-verabreichten 5XFAD-Mäusen weiter an (Abb. 3B, C, ergänzende Abb. 7A).Darüber hinaus stieg der Spiegel von p62, einem Marker des autophagischen Flusses [45,46,47], bei den 5XFAD-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen, während er bei 5XFAD-Mäusen durch Trametinib verringert wurde (Abb. 3B, D, ergänzende Abb. 7A).Während der Spiegel von reifem Cathepsin B, einer lysosomalen Protease, in den Vehikel-verabreichten 5XFAD-Mäusen abnahm, erhöhte Trametinib seinen Spiegel in 5XFAD-Mäusen (Abb. 3B, E).Darüber hinaus weist eine erhöhte LC3-LAMP1-Kolokalisation (Abb. 3F, G) im Kortex darauf hin, dass Trametinib die Autophagosom-Lysosom-Fusion induziert.Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Verabreichung von Trametinib die bei den 5XFAD-Mäusen beobachtete beeinträchtigte Autophagosom-Lysosom-Fusion und lysosomale Reifung rettete.A Analyse der Gehirnlysate von normalen Mäusen, denen 2 Wochen lang Trametinib verabreicht wurde.Heatmap von RNA-Seq für 29 ausgewählte Gene aus autophagischen lysosomalen Genen.Die Heatmap von RNA-Seq zeigt log10 FPKM-Werte (Fragmente pro Kilobase pro Million kartierter Lesevorgänge) für 29 ausgewählte Gene (Zeilen) und 6 Proben (Verabreichung von Vehikel oder Trametinib, n = 3 in jeder Gruppe).Die Farbe entspricht dem Z-Score pro Gen, der aus log10 FPKM berechnet und mit dem Morpheus-Heatmap-Programm dargestellt wird.B Repräsentative Western-Blot-Analyse von 5XFAD-Mäuse-Hirnkortex-Lysaten für angezeigte Proteine.C-Balken entsprechen der densitometrischen Analyse von LC3II/α-Tubulin.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM-Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 6) = 33,8, p = 0,0005; n = 3) dargestellt.D-Balken entsprechen der densitometrischen Analyse von p62.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM-Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 6) = 5,603, p = 0,0424; n = 3) dargestellt.E-Balken entsprechen der densitometrischen Analyse von Cathepsin B. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Analyse (F(2, 6) = 8,872, p = 0,0161; n = 3) dargestellt.F Immunfluoreszenzbilder von LC3 und LAMP1 in Kortexschicht V. Pfeile zeigen gemeinsam gefärbte Regionen (n = 3 Sagittalschnitte von jeder Maus, n = 3 Mäuse pro Gruppe).Maßstabsbalken, 10 μm.G Quantifizierung des Co-Stain-Verhältnisses mit LC3 und LAMP1.Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM Student's t-Test (p = 0,0381) dargestellt.Elife.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenHinweis des Herausgebers Springer Nature bleibt neutral in Bezug auf Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Verwendung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, solange Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen nennen. 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